Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение. Окраска по методу грама Окраска по граммам

Это основной способ, использующийся в бактериологии .

Основан на реакции основного парарозанилинового красителя (например, кристаллического фиолетового, метилового фиолетового или их смеси, так называемого генцианвиолета) с йодом.

Продуктом этой реакции является нерастворимое соединение темно-красного цвета в клеточной стенке бактерий. Это вещество удаляется обесцвечивающими растворителями (такими, как ацетон или спирт). Степень обесцвечивания зависит от структуры и толщины клеточной стенки.

Для демонстрации обесцвеченных микроорганизмов используют более светлый докрашивающий краситель.

Грамположительные микроорганизмы устойчивы к обесцвечиванию и остаются темно-пурпурными. Эта устойчивость не постоянна, и при продолжительном обесцвечивании краситель все же смывается.

Грамотрицательные микроорганизмы , как и весь цитологический препарат, окрашиваются в розовый цвет.

В культурах и образцах, содержащих грамположительные микроорганизмы, может содержаться какое-то количество грамотрицательных клеток, особенно если образцы старые.

В литературе описано 4 различных схемы окраски по Граму . Ключевыми моментами являются только порядок добавления реагентов, время обесцвечивания и тщательное удаление всех реагентов.

Существуют готовые наборы для окраски по Граму , к которым должна прилагаться инструкция от производителя.

Методика

1. Зафиксируйте мазок, проведя его несколько раз над пламенем

2. Залейте мазок 0,5% метиловым фиолетовым или 1% кристаллическим фиолетовым и оставьте на 1 минуту

3. Смойте водой

4. Залейте мазок 1% йодным раствором люголя и оставьте на 1 минуту

5. Смойте водой

6. Залейте 95% спиртом и осторожно покачайте, пока краска не перестанет смываться с мазка. Это займет не менее 30 секунд. Если мазок очень толстый, можно добавить свежий спирт для ускорения обесцвечивания.

7. Промойте стекло однократно водой

8. Покрасьте мазок 0,5% основным фуксином в течение 30 секунд, 0,1% нейтральным красным в течение 2 минут, или 0,5% сафранином в течение 10 секунд.

Примечания

• Для обесцвечивания можно использовать ацетон. Он действует быстрее, чем спирт (2 секунд бывает достаточно), но есть опасность слишком сильного обесцвечивания.
• Ацетон более опасен при попадании на кожу или на одежду.

Видео

Большинство красок, применяемых в микробиологии, принадлежат к производным бензола и добываются из каменноугольной смолы.

Красители применяемые в микробиологии, являются солями двух типов: 1) кислые красители – это те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), является анионом (примером может служить эозин); 2) основные красители – те, у которых роль хромофора играет катион (примером может служить метиленовый синий).

Красители первого типа являются кислыми потому, что хромофор, будучи кислотой, при образовании придающей окраску соли, связывается с основанием (NaOH).

Красители второго типа называются основными потому, что хромофор, будучи основанием, при образовании соли связывается с кислотой (HCl)/

Как правило, кислые красители связываются более интенсивно с цитоплазменными (основными) компонентами клетки, а основные – с ядерными (кислыми).

Действие некоторых красителей не зависит от образования солей или других химических соединений с окрашиваемым материалом. Они просто покрывают поверхность, адсорбируясь, растворяясь или осаждаясь в материале.

В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы

Существуют простые и сложные методы окрашивания микропрепаратов.

Простые методы окраски

Для простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.

Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.

При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.

Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.

Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.

К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.

Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.

Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.

Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.

Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.

Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.

В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.

Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.

Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).

По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается как бы негативное их изображение.

При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.

Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.

Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец а темном фоне препарата.

Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.

Сложные методы окраски

Простой метод позитивного или негативного способа окраски микроорганизмов очень удобен для самых разнообразных целей (изучение формы и расположения клеток, определение размеров, обнаружение капсул у микробных клеток в мазках – отпечатках из органов инфицированного организма и пр.).

Однако простой метод окраски не позволяет дифференцировать микроорганизмы (в том числе и бактерии) сходные по форме и размерам, но принадлежащие к различным видам, простой метод окраски не позволяет обнаружить зрелые споры и цисты, высыпавшиеся из клетки в окружающуюся среду, простой метод окраски не позволяет обнаружить клетки со сложной структурой оболочки и пр.

В силу этого большую ценность представляют сложные методы окраски, позволяющие получить представление не только о форме, размерах, расположении клеток друг относительно друга, по позволяющие дифференцировать микробы и определять структурные детали микробных клеток.

Среди сложных методов окраски большую ценность представляет способ окраски разработанный датским ученым Граммом, позволяющий дифференцировать микроорганизмы на две большие группы, называемые «грамположительными» и «грамотрицательными», что имеет большое значение при идентификации микроорганизмов.

Этот способ окраски называют дифференциальной окраской. В основе дифференциации микробов по Грамму лежит свойство клеточной оболочки и цитоплазматической мембраны.

Основой клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов является пептидогликан. У грамположительных микробов пептидогликан имеет несколько слоев, у грамотрицательных - он однослоен.

У грамположительных микробов, обладающих плотным и многослойным пептидогликаном, образовавшийся комплекс при окраске кристаллическим фиолетовым и последующей обработке йодным раствором не вымывается спиртом, и клетки не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовый цвет. В то время как грамотрицательные микробы, имея тонкий слой пептидогликана, обесцвечиваются спиртом. При дополнительной окраске фуксином или сапранином грамотрицательные клетки окрашиваются в сиреневато – красный цвет.

Микроорганизмы, которые сохраняют окраску, называются «грамположительными» и обозначаются «Г+», а обесцвеченные – «грамотрицательными» и обозначаются «Г-».

Показатели дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов:

Грамположительные микроорганизмы не чувствительны к действию желудочного сока, имеют не сложную структуру. Резистентные к щелочам, чувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Иммуногенные свойства выражены слабо, оптимум роста при относительно высоком рН. В живом состоянии более проницаемы для красителей, чувствительны к электролитам. Могут быть кислотоустойчивыми и могут образовывать споры. Имеют многослойный пептидогликан и могут содержать тейхоевые кислоты. Клеточная стенка пористая, содержит мало белков, пептиды по составу аминокислот однообразны. Липидов мало, много гликопротеидов (99%).

Грамотрицательные микроорганизмы в большинстве случаев растворяются под действием желудочного сока, растворяются в 1% растворе КОН, чувствительны к кислотам. Малочувствительны к лизоциму, пенициллину, йоду. Хорошо выражены иммуногенные свойства. Оптимум роста при низком рН среды. В живом состоянии плохо проницаемы для анилиновых красителей. Резистентны к слабым электролитам, спор не образуют. Основой клеточной стенки является однослойный пептидогликан, тейхоевая кислота отсутствует. Клеточная стенка малопористая, имеет сложную структуру, содержит все аминокислоты. Липидов много (до 22%), гликопротеидов мало (5 – 9%).

Растворы для окраски по методу Грамма:
1. Раствор А – кристаллический фиолетовый – 2,0г, этиловый спирт 95% - 20,0мл.
2. Раствор Б – щавелевокислый аммоний – 0,8г, дистиллированная вода – 80,0 мл.
Раствор А разводят дистиллированной водой (1:5) и затем смешивают его с равным объемом раствора Б.
3. Раствор Люголя – йод кристаллический – 1г, йодистый калий – 2,5г, дистиллированная вода – 80,0мл. Эту смесь оставляют на 24 часа для растворения йода.
4. Раствор для дополнительной окраски – сапранин или фуксин (2,5% раствор в 95% спирте) – 25 мл. Дистиллированная вода – 75мл.

Методика окраски по методу Грамма:
1. Фиксированный мазок, содержащий микробные клетки, окрасить генцианвиолетом (2 минуты).
2. Слить генцианвиолет, после чего нанести на препарат раствор Люголя (2 минуты).
3. Осторожно слить раствор Люголя и промыть препарат 95% этиловым спиртом (30 секунд. Клетки с многослойным пептидогликаном останутся окрашенными генцианвиолетом, с однослойным пептидогликаном – обесцветятся).
4. Препарат осторожно промыть струей воды.
5. Мазок окрасить раствором фуксина или сапранина (1 – 2 минуты).
6. Препарат осторожно промыть струей воды, высушить на воздухе при комнатной температуре или в потоке теплого воздуха над пламенем горелки, или осторожно промокнуть фильтровальной бумагой.
7. Препарат исследовать при помощи микроскопа.

К сложным дифференциально – диагностическим методам окраски относится также и окраска по методу Циль – Нильсена (Ziehl – Naelsen), позволяющая отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от других, не обладающих этим свойством.

Этот метод применяется главным образом для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, имеющих своеобразный химический состав, а именно – высокое содержание в клетке липидов. Окраска по Циль – Нильсену применяется для окраски микобактерий туберкулеза и родственных им микроорганизмов из рода Mycobacterium.

Приготовление и окраска микопрепарата по Циль – Нильсену проводится следующим образом:
1. Готовят обычным способом фиксированный мазок из исследуемого материала (мокрота больного или чистая культура).
2. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и на нее наливают раствор карболового фуксина. Предметное стекло зажимают в пинцет Корне и препарат в течение 4-х минут нагревают над пламенем горелки (по мере испарения жидкости раствор красителя добавляется).
3. Через 4 минуты (по окончанию прогревания) фильтровальную бумагу осторожно снимают с препарата и на мазок на 30 секунд наносится 5 – 10% раствор серной или соляной кислоты приготовленный на 95% этиловом спирте.
4. Через 30 секунд препарат осторожно промывают струей холодной воды и дополнительно докрашивают раствором метиленовой сини.

Механизм окраски кислотоустойчивых микроорганизмов по Циль – Нильсену можно объяснить следующим образом: во время нагревания препарата воск, входящий в состав оболочки, размягчается, и благодаря этому краситель проникает в бактериальную клетку. Остывая, этот воск удерживает краситель, поэтому спирт, с кислотой вымывают краситель только из клеток, не обладающих кислотоустойчивостью. При дополнительной окраске метиленовым синим окрашиваются обесцвеченные клетки и на этом синем фоне будут отчетливо видны кислотоустойчивые бактерии, окрашенные в красный цвет.

Растворы для окраски по Циль – Нильсену:
1. Раствор А – основной фуксин – 0,3г, этилдовый спирт 95% - 10,0мл.
2. Раствор Б – фенол (расплавленные кристаллы) – 5,0г, дистиллированная вода – 95,о мл.
3. Раствор метиловой сини Леффлера или бриллиантовой зелени.
Растворы А и Б смешивают (карболовый фуксин). Смесь хорошо сохраняется.

В микроскопической практике при изучении мазков – отпечатков из органов, мазки из крови, при изучении спирохет, простейших, хламидий, культур тканей широко применяется еще один сложный метод окраски – окраска по Романовскому – Гимза.

Методика окраски по Романовскому – Гимза:
1. Препарат высушивается, фиксируется в жидком фиксаторе (метанол 3 – 5 минут).
2. Препарат высушивают и помещают в стаканчик с рабочим раствором красителя (экспозиция 20 25 минут при 37 градусах, концентрация раствора краски и экспозиция должны быть титрованы). Перекрашенный мазок дифференцируется этиловым спиртом (50 – 60 градусным), споласкивается осторожно водой, высушивается и микроскопируется.

Растворы красителей для окраски по Романовскому – Гимза:
1. Вариант А. Готовят раствор – 3,8г сухой краски, состоящей из смеси эозина и метиленовой сини, растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта. Раствор оставляют на несколько дней, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем добавляют 250 мл чистого глицерина и оставляют на 3 – 5 дней часто взбалтывая. Полученный раствор – краска Романовского – Гимза.
Перед употреблением краску оттитровывают в разведениях 1:1, 1:2, 1:3 и т.д., приготовленных на дистиллированной воде в течении 20 – 25 минут.
2. Вариант Б. Применяют окраску азур – эозином.
а) 1 г сухой краски Романовского – Гимза (азур и метиленовая синь) растворяют в одном литре дистиллированной воды.
б) 1 г эозина растворяют в одном литре дистиллированной воды.

Эти два раствора хранят отдельно в темном месте в стеклянных емкостях с притертыми пробками.

Для окрашивания препаратов ex tempore готовят рабочий раствор:
10 мл дистиллированной воды
4 мл раствора эозина
8 мл раствора краски Романовского

Необходимым условием для получения хорошей окраски препаратов является качество воды (рН воды должно быть нейтральным).

Окрашивание по Граму - это экспрессный метод исследования, позволяющий установить наличие бактерий в образце и дифференцировать их как грамположительные либо грамотрицательные. Метод основан на химических и физических свойствах клеточной оболочки. Метод Грама почти всегда применяют в качестве первого шага при диагностике бактериальных инфекций .

Метод был предложен датским ученым Г.К.Грамом , который разработал его в 1882 и опубликовал в 1884 году, как способ, позволяющий дифференцировать сходные по симптомам бактериальные инфекции: Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Klebsiella pneumoniae .

Шаги

Часть 1

Приготовьтесь к работе. Наденьте перчатки и подвяжите длинные волосы, чтобы не загрязнить исследуемый образец. Выберите рабочее место под вытяжкой или в другом хорошо проветриваемом месте и продезинфицируйте его. Прежде чем приступить к работе, проверьте, исправны ли горелка Бунзена и оптический микроскоп.

Продезинфицируйте предметное стекло. Если предметное стекло недостаточно чистое, вымойте его водой с мылом, чтобы удалить жир и грязь. После этого продезинфицируйте его этанолом, очистителем для стекол или другим способом, который принят в вашей лаборатории.

Поместите образец на предметное стекло. Окрашивание по Граму позволяет увидеть отдельные бактерии в медицинских образцах или культуры бактерий в чашке Петри. Для начала нанесите на предметное стекло тонкий слой исследуемой жидкости. Рекомендуется не выдерживать образец дольше 24 часов, так как со временем у бактерий повреждаются клеточные стенки, и их реакция на окрашивание по Граму становится менее предсказуемой.

Зафиксируйте образец. Под действием тепла бактерии пристанут к стеклу, и их не смоет при окрашивании. Быстро проведите 2-3 раза предметным стеклом над верхней частью пламени горелки или нагрейте его на электрическом нагревателе. Не перегрейте предметное стекло, чтобы не внести изменения в образец. Если вы используете горелку Бунзена, следите, чтобы пламя было небольшим и имело вид голубого конуса, а не высокого оранжевого столба.

• Можно зафиксировать препарат и метанолом. Нанесите на высушенный образец 1-2 капли метилового спирта, слейте излишки спирта и высушите предметное стекло на воздухе. Данный способ предпочтительнее в силу того, что он меньше повреждает исследуемые клетки и дает более чистый фон.

1. Поместите предметное стекло в лоток для окрашивания. Этот лоток представляет собой неглубокое металлическое, стеклянное или пластиковое блюдце с мелкой сеткой для поддержки образцов. Положите стекло с препаратом на сетку, так чтобы используемая при окраске жидкость стекала в лоток.

   Нанесите на образец йод, затем смойте его. С помощью пипетки покройте образец йодом. Оставьте йод хотя бы на 60 секунд, после чего аккуратно смойте его водой так же, как раньше смыли краситель. Йод в виде отрицательно заряженных ионов взаимодействует с ионами КФ+, в результате чего во внешних и внутренних слоях клеток формируются крупные комплексы кристаллвиолета и йода. Это фиксирует попавший в клетки кристаллвиолет.

   • Йод является едким веществом. Избегайте контакта йода с кожей, не глотайте его и не вдыхайте его пары.

2. Добавьте обесцвечивающее вещество и сразу же смойте его. Обычно используют смесь ацетона и этанола в пропорции 1:1, при этом следует аккуратно выдержать время. Расположите предметное стекло под углом и добавляйте на него обесцвечивающее средство до тех пор, пока стекающая жидкость не потеряет фиолетовый оттенок и станет прозрачной. Обычно это занимает не более 10 секунд, особенно если обесцвечивающий раствор содержит большое количество ацетона. Если вы вовремя не остановитесь, раствор может вымыть краситель как из грамположительных, так и грамотрицательных клеток, и вам придется повторить процедуру окрашивания. Немедленно смойте остатки обесцвечивающего раствора так же, как делали это ранее с красителем.

   Нанесите на образец контрастный краситель и смойте его водой. Контрастный краситель, в качестве которого используют обычно сафранин или фуксин, позволяет получить дополнительный контраст между грамположительными и грамотрицательными клетками за счет того, что окрашивает бесцветные (грамотрицательные) бактерии в розовый или красный цвет. Оставьте контрастный краситель на образце хотя бы на 45 секунд, после чего смойте его водой.

   Высушите предметное стекло. Можно просто оставить его на воздухе, либо промокнуть фильтровальной бумагой. После этого окрашивание по Граму завершено.

Часть 3

Подготовьте оптический микроскоп. Положите стекло с образцом на предметный столик. Бактерии значительно различаются по размерам, поэтому вам может понадобиться увеличение от 400x до 1000x. При тысячекратном увеличении для лучшего контраста рекомендуется использовать объектив с масляной иммерсией. Нанесите на предметное стекло каплю иммерсионного масла, и при этом старайтесь, чтобы стекло не двигалось, иначе в масле могут образоваться пузырьки. Затем с помощью турели микроскопа выставьте необходимый вам объектив так, чтобы он коснулся масла.

• Метод масляной иммерсии применим лишь для специальных, а не "сухих" объективов.

1. Определите грамположительные и грамотрицательные бактерии. Рассмотрите предметное стекло под оптическим микроскопом. Грамположительные бактерии будут окрашены в фиолетовый цвет, поскольку внутри их толстых клеточных стенок оказался кристаллвиолет. Грамотрицательные бактерии должны быть розовыми или красными, так как кристаллвиолет был вымыт через их тонкие клеточные стенки, после чего в них проник розовый контрастный краситель.

   • Если образец слишком толст, это может привести к ошибочным положительным результатам. Если бактерии всех типов выглядят как грамположительные, окрасьте еще один образец, чтобы удостовериться в правильности результатов.
   • Если образец слишком долго находился под воздействием обесцвечивающего раствора, это может привести к ошибочным отрицательным результатам. Окрасьте еще один образец, чтобы убедиться в том, что все бактерии действительно грамотрицательные.

2. Сравните свои результаты с эталонными изображениями. Если вы не уверены в том, какие бактерии видите, то просмотрите набор эталонных изображений, которые отсортированы по форме бактерий и результатам окрашивания по Граму. Подобный набор можно найти в Интернете на National Microbial Pathogen Database , Bacteria in Photos и многих других сайтах. Ниже приведены наиболее распространенные или важные для диагностики примеры, которые помогут вам идентифицировать бактерии.

   Распознайте грамположительные бактерии по форме. Вид бактерий можно определить по их форме в микроскопе: часто это бывают кокки (округлые) и бациллы (палочковидные). Вот несколько распространенных форм грамположительных (фиолетовых) бактерий:

   Распознайте грамотрицательные бактерии. Часто грамотрицательные (розовые) бактерии разделяют на три группы: кокки (округлые), палочковидные (длинные и тонкие) и кокковидные, которые имеют промежуточную форму.

   Оцените неоднозначные результаты. Некоторые бактерии не поддаются однозначному окрашиванию из-за того, что их клеточные стенки непрочны или покрыты жирами. Такие бактерии могут одновременно окрашиваться в фиолетовый и розовый цвет в пределах одной клетки, либо клетки одного и того же вида могут окрашиваться по-разному в одном мазке. Подобная проблема может наблюдаться на любом образце бактерий, который пролежал более 24 часов, однако некоторые виды бактерий подвержены этому независимо от свежести образца. В этом случае для точного определения бактерий могут понадобиться более специализированные методы, такие как окраска по Цилю-Нильсену, наблюдение за ростом культуры, тест TSI (тройной сахар железа), генетическое тестирование.

   Выбросьте использованные материалы. Процедура утилизации отходов зависит от конкретной лаборатории и того, какие материалы использовались. Как правило, жидкость из лотка для окрашивания считается опасным материалом и переливается в плотно закрывающиеся бутылки. Использованные предметные стекла вымачиваются в 10%-ном растворе отбеливателя, после чего помещаются в контейнеры для сбора и утилизации игл и медицинских отходов.

Что вам понадобится

• Образец ткани
• Стеклянные предметные стекла
• Пипетка
• Источник пламени, нагреватель предметных стекол или метанол
• Кристаллический фиолетовый
• Обесцвечивающая жидкость, например спирт или ацетон
• Сафранин

Дополнительные статьи

источников

1. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.
2. Gram, HC (1884). "Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten" (in German). Fortschritte der Medizin 2: 185–9.
3. http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2886-gram-stain-protocols
4. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2
5. http://www.austincc.edu/microbugz/gram_stain.php
6. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2
7. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (предложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознавательных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристалл-виолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грам+). Например, спорообразующие бактерии родов - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам+ бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан-виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам- бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопротиидов и липополисахаридов. Грам- бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам+ отличаются от грам- не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам+ видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам-бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам+ в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.

Окраска по Граму проводится следующим образом:

1. На одном предметном стекле готовят три мазка из бактериальных культур: заведомо известной Грамположительной, исследуемой и заведомо известной Грамотрицательной.

2. Мазки высушивают и фиксируют пламенем.

3. Окрашивают карболовым раствором генциан-виолета в течение 1-2 мин.

4. Краску удаляют стряхиванием, на мазки наносят раствор Люголя (раствор J и КJ) и выдерживают 1-2 мин. до почернения мазка.

5. Сливают раствор Люголя и на препарат наносят несколько капель 96% спирта и слегка покачивая стекло, выдерживают его до осветления мазка. (20-30 сек).

Препарат немедленно промывают водой. От обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработку все бактерии сохраняют окрашивание, при излишней – все клетки обесцвечиваются.

6. Дополнительно окрашивают препарат фуксином Пфейффера (разведенный фуксин) в течение 2 мин.

7. Краску смывают, препарат подсушивают и смотрят с иммерсионным объективом 90х.

Если препарат приготовлен правильно, то в поле зрения видны грам + темно-фиолетовые клетки и рядом с ними хорошо различаются бледно-розовые грам- клетки.

1. На препарат кладут полоску фильтровальной бумаги, окрашенной карболовым генцианвиолетом, и смачивают несколькими каплями воды.

2. Через полторы-две минуты бумажную полоску снимают и на препарат наносят раствор Люголя на 1 минуту.

3. Сливают раствор Люголя и, не промывая водой, действуют спиртом несколько секунд, до прекращения отхождения красителя от мазка.

4. Тщательно промывают препарат водой.

5. Докрашивают разведенным фуксином 1-2 минуты.

6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают препарат с иммерсионной системой.

Грамположительные микробы - фиолетового цвета, грамотрицательные - красного.

2. В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий иногда используют неокрашенные препараты (нативные), приготовленные из естественный образцов либо из колоний выросших микроорганизмов. Нативные препараты чаще всего готовят для исследования живых неокрашенных бактерий в целях установления их подвижности. Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя светлопольный микроскоп с приспущенным конденсором, но лучше всего его исследовать в темном поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа. Для прижизненного изучения бактерий часто используют методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами.

Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды. В нее стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и накрывают покровным стеклом. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю. Препарат микроскопируют с использованием объективов х40 или х90.

Препарат «висячая капля» используют при продолжительном наблюдении за ростом и развитием микроорганизмов. Небольшая капля бульонной культуры микроорганизмов помещается с помощью бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с лункой. Капля должна свободно свисать в лунку, не затрагивая ее краев и дна. Для создания влажной камеры и предохранения от высыхания края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют также, как и препарат «раздавленная капля».

Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском.

Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитри-хиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания. Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, КА1(SO4)2, НgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности.

Подвижность бактерий может быть выявлена путем использования техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 - 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды.

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Методика окраски по Граму

2. Приготовление препарата «висячая капля» из живых подвижных бактерий (вибрион), микроскопирование в фазово-контрастном микроскопе.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Приготовить препараты из грамположительных и грамотрицательных культур (стафилококка, антракоида, кишечной палочки, вибриона), окрасить по Грамму, микроскопировать, зарисовать.

2. Приготовить препарат «раздавленная капля» из зубного налета и чистой культуры водного вибриона, микроскопировать в темном поле, зарисовать результат.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. В чем заключаются различия в анатомии эукариот и прокариот?

2. Какие свойства бактерий можно изучить в результате окраски простыми и сложными методами?

3. Какие методы окраски называют дифференциальными? Назовите их.

4. Какие свойства бактерий влияют на их способность воспринимать

разные красители?

5.Какой метод окраски позволяет разделить все бактерии на две альтернативные группы?

6.Каково строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий?

7. Объясните последовательность и механизм окраски по Граму. В какой цвет при этом могут окрашиваться бактерии и почему?

8. Назовите морфологические разновидности грамположительных и грамотрицательных бактерий.

9. Какое значение имеют жгутики в биологии бактерий?

10. Как определяют подвижность бактерий микроскопическим методом?

11. Как определяют подвижность бактерий методом посевов?

12. Какое практическое значение имеет изучение подвижности бактерий?

13. Как готовятся «висячая» и «раздавленная» капли и каковы особенности их микроскопии?

14. Какие существуют варианты расположения жгутиков у бактерий?

15. Как обнаружить жгутики у бактерий?

ЗАНЯТИЕ №3

Тема:

Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски (продолжение).

План занятия:

1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля - Нильсена.

2. Выявление спор у бактерий. Окраска по Ожешко.

3. Выявление капсул у бактерий. Окраска по Бурри-Гинсу.

4. Выявление включений по методу Нейссера.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

1. Кислотоустойчивые бактерии обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, щелочам и спиртам, что связано с наличием в теле микроба нейтральных жиров, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведенными растворами красителей. Для выявления кислотоустойчивых бактерий применяют концентрированные красители, приготовленные в растворе карболовой кислоты, и подогревание. Карболовая кислота при подогревании разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства. При последующем воздействии серной или азотной кислотой тело микробной клетки не обесцвечивается, что дает возможность отличить кислотоустойчивые микроорганизмы от бактерий, не обладающих этим свойством. К патогенным кислотоустойчивым бактериям относятся палочки туберкулеза и проказы. К непатогенным - палочка смегмы, нередко находящаяся в моче человека, а также микробы, встречающиеся в организме холоднокровных, на различных злаках, в почве, навозе, молоке, масле. В отличие от туберкулезных бактерий они обесцвечиваются спиртом. Окраска кислотоустойчивых микробов производится по методу Циля - Нильсена.

2. Споры у бактерий образуются при неблагоприятных условиях существования микроба. По расположению споры могут находиться в центре микробной клетки, например у сибиреязвенной палочки, ближе к концу; субтерминально - у Cl.perfringens; и на конце (терминально) - у палочки столбняка. Спорообразование наблюдается среди некоторых палочковидных бактерий и актиномицет. Образование спор происходит в присутствии кислорода и при температуре не ниже 15° и не выше 43°. Споры очень устойчивы к температуре, погибают при кипячении в течение 2-6 часов, при стерилизации в автоклаве (при температуре 120°) погибают в течение 16-30 минут. Споры у бактерий служат для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды.

Бактериальные споры могут быть выявлены с использованиемкак простых, так и сложных методов окраски. Простой метод: микроорганизм, например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина, окрашивается в зеленый цвет, споры при этом бесцветные, а фон - черный. Наиболее часто применяют сложные методы окрашивания эндоспор по Ожешко и по Шефферу - Фултону.

3. Капсула располагается поверх клеточной стенки и представляет ослизненную клеточную оболочку. Патогенные бактерии образуют капсулу только находясь в организме животных или человека, а при культивировании может появляться при добавлении к питательной среде нативного белка. Капсула защищает их от действия фагоцитов и антител. "Капсульные" бактерии образуют капсулу и в организме, и на питательных средах, где они дают характерный слизистый рост. Для обнаружения капсул у бактерий применяют специальные методы окраски. Чаще всего используется метод Гинса.

4. В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигментные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans , по наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis , а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило названиеметхромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами - запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен. Метод Нейссера основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином краска Нейссера вытесняется из бактериальной цитоплазмы, которая принимает теперь желтую окраску. Зерна волютина, прочно фиксировав­шие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а палочки - желтого.

Цель занятия

1. Освоить методы микроскопического выявления структурных элементов клетки (споры, капсулы, включения, оболочка кислотоустойчивых бактерий).

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Структурные элементы бактериальной клетки, их назначение и роль в распознавании микробов.

2. Методы микроскопического изученияструктурных элементов бактериальной клетки:

Оболочка кислотоустойчивых бактерий (окраска по Цилю - Нильсену)

Споры (окраска по Ожешко);

Зерна волютина (окраска по Нейссеру);

Капсулы (окраска по Бурри и по Бури - Гинсу).

Уметь:

1. Окрашивать препараты сложными методами в целях выявления кислотоустойчивых бактерий, спор, зерен волютина у дифтерийной палочки, капсул у бактерий.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Для выявления туберкулезных бактерий обычно исследуют мокроту. Пинцетом или препаровальными иглами наносят комочек мокроты на середину предметного стекла, затем его покрывают вторым пролетным стеклом, так чтобы одна треть нижнего и одна треть верхнего стекла были свободными. Затем берут за свободные концы стекла и растирают комочек между ними, после чего раздвигают оба стекла. Таким образом, получаются два мазка, которые затем высушивают на воздухе и фиксируют на пламени.

На фиксированный мазок мокроты, для окраски туберкулезных бактерий по Цилю - Нильсену, кладут листок фильтровальной бумаги размером меньше предметного стекла и наливают на него карболовый фуксин Циля. Окрашиваемый мазок подогревают на пламени до появления пара, который хорошо заметен, если смотреть на препарат сбоку, так его подогревают 2-3 раза.

Препарату дают остыть, сбрасывают бумажку с краской и наносят 5% серную или 25% азотную кислоту до появления желтого окрашивания, после чего быстро и тщательно промывают водой.

Докрашивают препарат метиленовой синькой в течение 4 -6 мин, после чего промывают водой, высушивают и рассматривают под иммерсионной системой.

Туберкулезные палочки окрашиваются в рубиново - красный цвет, а форменные элементы, некислотоустойчивые бактерии в синий цвет.

Для окрашивания спор по методу Ожешко готовят густой мазок на одном конце предметного стекла и высушивают на воздухе, после чего на него наносят 1% раствор соляной кислоты и нагревают на пламени до появления паров в течение 1-2 минут. Препарат промывают водой, высушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циля - Нильсена. При иммерсионной микроскопии обнаруживают красного цвета споры и синего цвета вегетативные тела.

Метод Шеффера - Фултона : фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 - 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров. Сняв фильтровальную бумагу, препарат промывают водой и в течение 30 сек. докрашивают 0,5 % раствором сафранина и вновь промывают водой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка - в красный.

Для выявления капсул по методу Гинса на предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок, как мазок крови: ребром одного стекла проводят по поверхности другого. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой. На темно-дымчатом фоне препарата видны розовые клетки микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.

Для выявления зерен волютина на фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 мин. Сняв бумагу, промывают мазок водой. Наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания. Промывают водой, докрашивают мазок водным раствором этиленового синего в течение 3-5 мин., вновь промыв водой, высушивают и микроскопируют

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Приготовление препаратов из нативной мокроты иих окраска по Цилю-Нильсену.

2. Окрашенные препараты, приготовленные из мокроты туберкулез­ных больных и из чистой культуры дифтерийной палочки.

3. Споры антракоида, окрашенные по методу Шефера-Фултона.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА

1. Приготовить препарат из культуры Corynebacterium, окрасить по Цилю-Нильсену, микроскопировать и зарисовывать.

2. Приготовить препарат из Кl.pneumoniae или К1.ozaenae методом Бурри-Гинса, микроскопировать и зарисовать их.

3. Микроскопировать окрашенные по Ожешко препараты спор антра­коида и зарисовать их.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие палочковидные формы принято называть бациллами?

2. В каких условиях образуется капсула у бактерий?

3. В каких условиях образуется спора у бактерий?

4. Каково назначение капсулы у бактерий?

5. Каково назначение споры у бактерий?

6. Какие химические вещества входят в состав капсулы?

7. Как обнаружить капсулу у бактерий?

8. Каким преимущественно формам бактерий присуще спорообразование?

9. Как можно убить спору?

10. Чем обусловлена кислотоустойчивость спор?

11. В какой цвет окрашиваются кислотоустойчивые бактерии по методу Циля-Нильсена?

12. Чем обусловлена кислотоустойчивость бактерий?

13. Каково назначение зерен волютина?

14. Как можно выявить зерна волютина?

15. Что такое метахромазия?

16. Какое значение имеетобнаружение зерен волютина у бактерий?

ЗАНЯТИЕ №4

Тема:

Морфология спирохет, грибов, риккетсий, хламидий, простейших, вирусов (бактериофагов).

План занятия:

1. Особенности морфологии спирохет.

2. Изучение морфологии нитчатых и дрожжеподобных грибов.

3. Морфология облигатных внутриклеточных бактерий (риккетсий и хламидий).

4. Изучение морфологии простейших.

5. Морфология вирусов. Бактериофаги: строение бактериофагов, по­лучение бактериофагов, титрование. Применение в медицине.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Спирохеты (трепонемы, боррелии, лептоспиры). Бледная трепонема вызывает сифилис, боррелии - возвратный тиф и клещевой боррелиоз (болезнь Лайма), лептоспиры - желтушный лептоспироз.

Оболочка спирохет тонкая, эластичная, содержит большое количество липопротеидов и тонкий не сплошной слой пептидогликана. Обычными методами трепонемы не окрашиваются, так как при фиксации спиртом оболочка легко разрушается и клетка не в состоянии удерживать красители. Спирохеты также, как и простейшие, плохо окрашиваются анилиновыми красителями. Для их дифференцирования применяют краску Романовского-Гимзы или микроскопируют нативные препараты в темном поле или в фазово - контрастном микроскопе (при сифилисе, лептоспирозе).

Грибы представляют собой растительные организмы, лишенные хлорофилла. В отличие от бактерий, клетки грибов имеют дифференцированное ядро и размножаются бесполым и половым способом. По особенности строения мицелия и образования половых спор грибы делят на несколько классов.

Представители класса фикомицетов имеют несептированный мицелий и относятся к низшим грибам (мукоровая плесень). Мукоровые грибы представляют собой сильно разветвленную клетку, от которой отходят плодоносящие гифы - спорангеносцы с шароподобными образованиями наверху - спорангиями, наполненными эндоспорами. К классу аскомицет относятся аспергиллус и пенициллиум. Аспергилус имеет расчлененный мицелий, одноклеточный конидиеносец, на головке которого веерообразно расположены короткие стеригмы, от которых отшнуровываются экзоспоры (при микроскопии напоминают струйки вытекающей из лейки воды). У пенициллиума и конидиеносцев многоклеточных, плодоносящее тело имеет вид кисточки. Представители этих двух классов грибов широко распространены в природе и, как правило, ведут сапрофитический образ жизни. В отдельных случаях могут вызывать поражение дыхательных путей, среднего уха, глаз.

Дрожжеподобные грибы рода Candida являются одноклеточными микроорганизмами. Диаметр клеток варьирует в пределах 2-15 микронов. Клетки дрожжеподобных грибов одеты отчетливо заметной оболочкой, имеют цитоплазму, компактное ядро, вакуоли и разнообразные включения. Почкование является единственной формой размножения этих грибов. Форма почек округлая или слегка грушевидная. Наружных спор (типа конидий), и внутренних (типа аскоспор), дрожжеподобные грибы не образуют, чем и отличаются от истинных дрожжей, аскомицетов и конидиальных организмов. Некоторые виды Candida образуют хламидоспоры, диаметр их достигает 10 -20 микронов, форма округлая, оболочка толстая, двухконтурная. Хламидоспоры возникают на концах псевдомицелия из укрупненных клеток, называемых протохламидоспорами.

Настоящего мицелия дрожжеподобные грибы также не имеют. Образование нитей (филаментация) происходит за счет удлинения клеток и расположения их в длинные цепочки. Такие нити называют псевдомицелием и отличаются они от истинного мицелия тем, что не имеют общей оболочки и перегородок, а состоят из длинных клеток, образующихся путем последовательного бокового или концевого почкования. В патологии человека определенную роль играют дрожжеподобные грибы из рода Candida, поражающие чаще всего слизистую желудочно-кишечного тракта.

Лучистые грибки - актиномицеты - по строению совмещают свойства бактерий и грибов. В патологии человека встречаются актиномицеты, вызывающие актиномикоз - заболевание, характеризующееся образованием лучистых друз в гнойно-воспалительных инфильтратах различных тканей. Представители семейства Streptomycetaceae служат источником для получения антибиотиков.

По П. Ф. Здродовскому, наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсий): 1) кокковидные (0,5мкм), 2) палочковидные (короткие -1-1,5мкм), 3) бациллярные (длинные, изогнутые - 3 – 4 мкм), 4) нитевидные (20 -40мкм). Все формы полиморфны.

Риккетсии окрашивают по Граму (грамотрицательны), по Романовскому - Гимзы и по Здродовскому.

Хламидии - грамотрицательные, мелкие кокковидные бактерии, размножаются только в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, т.е., как и риккетсии, они относятся к числу облигатных внутриклеточных бактерий. Попавшие в чувствительную клетку элементарные тельца хламидий превращаются в ретикулярные тельца, которые делятся пополам. После нескольких делений образуются промежуточные формы, превращающиеся затем в элементарные тела. У человека хламидии вызывают трахому, орнитоз и венерическую болезнь.

Хламидии обычно выявляются в клетках плоского, а не цилиндрического эпителия. Клетки с хламидиями располагаются группами по 4 - 6 штук; хроматин в них распределен причудливо, грубые его нагроможде­ния чередуются с просветлениями, цитоплазма клетки слегка вакуолизирована. В части случаев хламидии располагаются в виде внутриклеточных элементарных телец. Позднее они становятся крупнее, делаются менее плотными и располагаются внутри крупной вакуоли вблизи ядра. Хламидии чувствительны к тетрациклинам, макролидам и рифампицину, а L-формы бактерий чувствительны к эритромицину и рондомицину.

Хламидии окрашивают по Романовскому - Гимзе, они хорошо видны в нативных препаратах при фазово-контрастной микроскопии. Чаще всего для их выявления в соскобах клеток применяют метод иммунной люминесцентной микроскопии.

Простейшие имеют более сложную функциональную организацию по сравнению с бактериями и грибами. Снаружи тело простейших покрывает эластичная и ригидная мембрана - пелликула, образованная внешним слоем цитоплазмы. У некоторых видов клеточная мембрана может вклю­чать опорные фибриллы и даже минеральный скелет. Клеточная структу­ра и набор органоидов идентичен клеткам многоклеточных животных орга­низмов. Многие простейшие активно двигаются за счет псевдоподий, жгутиков или ресничек.

Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей возбудителя и значительно зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации.

Морфология простейших изучается как в живом их состоянии, так и в окрашенном виде. Простая окраска (фуксином или метиленовой синей) непригодна, так как она не позволяет выявить сложную структуру этих микроорганизмов. Наиболее простым способом, дифференцирующим отдельные элементы клетки, является метод окраски по Романовскому - Гимзе. При этом фиксация мазков должна производиться не на пламени, а в каком-либо фиксаторе (например, смесью спирта с эфиром по Никифорову). При выявлении подвижности лучшие результаты достигаются, при применении подогрева предметного столика и исследовании в первые 30 минут после взятия материала.

Вирусы - автономные, проходящие через бактериальные фильтры генетические структуры, способные функционировать и репродуцироваться в восприимчивых клетках животных, растений, бактерий, простейших, грибов.

Вирусная частица - вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой - капсидом. У некоторых вирусов капсид покрыт дополнительной оболочкой. Капсид состоит из субъединиц - капсомеров, имеющих чаще всего симметричное строение. Особенностями вирусов являются: фильтруемость, неспособность размножаться на искусственных питательных средах, отсутствие собственных белоксинтезирующих систем, наличие только одной какой-либо нуклеиновой кислоты, дисъюнктивный (разобщенный) способ размножения.

Вирусы, поражающие бактерии (бактериофаги), имеют сперма-тозоидную форму. Они состоят из головки, содержащей нуклеиновую кислоту, и отростка. Некоторые фаги не имеют отростка, или он очень короткий. Проникновение фага в бактериальную клетку может закончить­ся гибелью клетки и выходом фага (продуктивная инфекция-вирулентный фаг). В других случаях геном фага интегрирует с геномом клетки. Клетка не погибает, а геном фага репродуцируется с геномом клетки. Такая культура бактерий называется лизогенной. Лишь в отдельных клетках лизогенных бактерий фаг размножается и вызывает гибель клеток (умеренный фаг). Бактериофаги получают путем фильтрации материала через бактериальные фильтры. Количество бактериофагов можно определить путем серийных разведений с последующим добавлением их к индикаторным бактериям, выращиваемым на жидкой питательной среде (метод Аппельмана) или выращиваемым на плотной среде в чашках (метод Грациа).

Цели занятия:

1. Изучить особенности строения спирохет, хламидий, риккетсий, нит­чатых и дрожжеподобных грибов, простейших, вирусов, в том чис­ле бактериофагов.

2. Познакомиться с лечебно-профилактическими и диагностическими препаратами из бактериофагов.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Морфологию спирохет (трепонем, боррелий, лептоспир).

2. Морфологию нитчатых и дрожжеподобных грибов.

3. Морфологию простейших (лямблий, трихомонад, токсоплазм, дизентерийной амебы, малярийного плазмодия).

4. Морфологию хламидий, риккетсий и вирусов, в том числе бактериофагов.

5. Получение бактериофагов, титрование, применение в медицине.

Уметь:

1. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов в готовых препаратах.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Методика окраски спирохет по методу Романовского-Гимзы.

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет.

Для изучения морфологии грибов необходимо на предметное стекло нанести каплю воды, в которую препаровальными иглами вносится и расправляется мицелий грибов; препарат прикрывается покровным стеклом и рассматривается под сухой системой микроскопа. Мицелий у мукора одноклеточный, несептированный, а у аспергилла и пеницилла-многоклеточный. У мукора органы плодоношения представлены в виде большого спорангиеносца с эндоспорами, у аспергилла конидиеносцы несептированные в виде лейки, у пеницилла - сортированные в виде кисти рук.